作者：徐建业 周琦 卢萍 汤伟 董莲芳

    [搞要]  目的  探讨加温逆转肿瘤细胞株KBV200多药耐药性及与诱导细胞凋亡的关系。方法用四唑蓝快速比色法(MTT法)检测细胞存活率；用形态学(光镜、电镜观察)；生化学(DNA末端转移标记法．TUNEL法)及流式细胞术分析细胞凋亡状况。结果  加温42℃，l h可明显降低KBV200细胞存活率，提高长春新碱细胞毒性作用；单加VCR细胞存活率为(90.70±8.78)％．加VCR加温为(57.40±21.55)％，P＜0.002。加温与细胞分化剂CDA-II合用，有明显协同逆转作用。CDA-II与VCR合用细胞存活率为(59.24±30.80)％，加温与CDA-II及VCR合用为(15.32± 2.68)％，P＜0.05。42℃或43℃处理l，24h后即可观察到明显细胞凋亡。43℃ 1 h处理诱导作用更强。结论  加温可明显逆转肿瘤细胞多药耐药及诱导细胞凋亡。加温对肿瘤细胞凋亡的诱导，在加温逆转肿瘤细胞耐药性中可能起着重要作用。
[关键词]  高温，诱发；KB细胞；脱噬作用；抗药性．多药
    加温作为肿瘤治疗的一种新方法，已在临床上应用[1]，但加温逆转肿瘤细胞多药耐药性的报道不多见，加温与细胞分化剂(CDA—II)[2]协同逆转作用尚未见报道。近年来随着对细胞凋亡认识的不断深入，发现细胞凋亡不仅是一个正常的生理机制，也是肿瘤细胞接受各种化疗药物后的死亡机制[3]。肿瘤细胞凋亡的机制，可以说是一种更带普遍性的多药耐药机制。因此，肿瘤细胞凋亡的诱导，可能与耐药性的逆转有关。我们以肿瘤多药耐药细胞株KBV200为细胞模型，对加温逆转肿瘤细胞多药耐药性及与诱导细胞凋亡的关系进行了探讨。
    材料和方法
细胞株：KB(敏感株)及KBV200(耐药株)由中国医学科学院药物研究所药物室提供[4]，KBV200是该室对鼻咽癌上皮癌细胞株KB细胞长期长春新碱(VCR)诱导和克隆筛选建立的耐药菌株，对多种抗肿瘤药物耐药，肿瘤多药耐药基因(MDRI)显著表达。 KBV200对VCR耐受性为KB细胞170倍。
药物和试剂：长春新碱(VCR)为杭州产，柔红霉（DNR）为意大利产，细胞分化剂(CDA—II)由廖明徽博土惠赠．MTT为美国产，细胞凋亡(TUNEL法)检测试剂盒为德国产。
    细胞培养：细胞常规培养(37℃，5％CO2饱和湿度)于RPMI 1640中，加入10％小牛血清及200n mol／L浓度VCR．实验前1周撤药.胰酶消化，计数，调整适当浓度进行实验。
    细胞存活率测定：采用四唑蓝快速比色法(MTT法)[5]，其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将MTT(四甲基偶氮唑蓝)转化成为蓝紫色衍生物．其颜色深浅(可用吸光度“A”值表示)与活细胞数呈正比。因此，可通过酶标仪测定吸光度，了解抗癌药作用后肿瘤细胞存活率。具体操作：取对数生长期细胞，调整细胞浓度为(0.75—1.00)x 104／ml每孔200μl加入96孔板，每组设3个平行孔，取实验组3孔A值平均值/对照组3孔A平均值x 100％。即
为细胞存活率。
    加温处理：将浓度为2x 104／m1细胞加入培养瓶内，培养1 d后按设计方案加药、加温，再培养3d．胰酶消化，将细胞彻底洗脱，200μl细胞悬浓加入96孔板，每组3个平行孔，培养1d后作MTT方法见上。
    实验分组：加温对VCR、DNA细胞毒作用，共分8组。即对照组(C)加生理盐水；单独加温组(C +T)；单独加VCR组(C十V)；单独加DNR组(C十D)；光加VCR后加温组(C十V十T)；先加温后加VCR(C十T十V)；先加DNR后加温组(C十D十T)；先加温后加DNR组(C+T+D)。加温处理条件为加温42℃ 1h。VCR浓度200n mol／L，DNR浓度l μg／m1。每项实验至少重复3次以上。
    加温与CDA-II协同逆转作用．共分4组。即单独加CDA—II(C十CDA—II)；同时加CDA-II及加温(C十CDA-II十T)；同时加CDA-II及加VCR(C十CDA-II十VCR)；同时加CDA-II、VCR及加温(C十CDA-II十VCR十T)。C为KBV200．加温42℃，1 h，VCR浓度200n mol／L．CDR-II为1μ／m1。每项实验至少重复3次以上。
    形态学光镜观察细胞凋亡：于24孔板中放人0.5cm2玻片，每孔加入1m1含KBV200细胞2 x 104培养液，培养4h后进行加温或加药处理：根据不同处理时间，取出小玻片，室温干燥，瑞氏染色，光镜下观察。
末端脱氧核苷酸标记法检测细胞凋亡：细胞处理同上，4％多聚甲醛室温固定30min, PBS洗3次．然后按药盒操作说明进行。
细胞凋亡形态特征：加温处理后细胞变小．核聚集、浓缩、断裂，出现凋亡小体。TUNEL法染色定位于细胞核，呈棕黄色，浓缩核质紧贴核膜，或核质呈均匀染色，可见凋亡小体。每张玻片高倍视野(400 x )计数500个细胞，计算百分率，每项实验设立不加温对照组。
电镜观察细胞超微结构改变：常规固定、透射电镜观察。
流式细胞仪分析细胞凋亡：使用FACS．Calibur型(美国)进行。所得数据Modfit LT.2.o版软件进行分析，根据DNA含量组方图中出现“亚G1蜂”计算细胞凋亡百分数[6]。
统计方法：采用t检验，结果以ˉx±s表示。

结果

    加温对VCR、DNR细胞毒性作用的影响：单独加温或加VCR后再加温．与对照组比均明显降低KBV200细胞存活率(P＜0.01，P＜0.002)，表明加温可明显降低KBV200细胞对VCR耐受性。但加温后加VCR，与对照比差异不显著(P＞0.2)．加温使DNR对KBV200细胞毒作用增强，但与刘照比无明显差异(P＞0.2)，而且加药与加温顺序对结果影响不明显(P＞0.1)，见表l。
表1  加温对VCR、DNR细胞毒作用的影响（%）

组别	ˉx±s	t值	p值
C	100
C+T	75.12±23.30	3.09	<0.01
C+V	90.20±8.97
C+ V +T	57.40±21.55	3.93	<0.002
C+ T+V	83.67±11.21	0.75	>0.2
C+D	62.41±12.92
C+D+ T	42.95±23.10	1.27	>0.1
C+ T+D	52.23±15.00	1.80	>0.1

 加温与CDA—II协同逆转作用：CDA—II单独加温或CDA—II十VCR后再加温与不加温组比较差异均有非常显著性或显著性(P＜0.001或P＜0.05)。CDA—II十VCR+T对细胞毒性作用很强，细胞存活率仅为15％左右。表明加温与CDA—II合用可大大降低KBV200细胞对VCR耐受性(表2)。
    细胞凋亡结果：加温可诱导KBV200细胞发生凋亡。光镜及电镜下均可观察到细胞发生凋之典型形态．光镜观察与TUNEL法结果一致。42℃ 1 h加温处理．24h凋亡发生率13％；43℃ 1 h发生率35％；对照组末见凋亡细胞(图1)。
表2  加温与CDA—II协同逆转作用（％）

组别	ˉx±s	t值	p值
C+CDA-II	93.16±5.20
C+CDA-II+T	51.77±6.41	13.1	<0.001
C+CDA-II+VCR	59.24±30.80
C+CDA-II+VCR+T	15.32±2.68	2.75	<0.05

加温24h后，流式细胞仪分析．同样证实有细胞凋亡发生，温度升高，凋亡程度增强。 42℃ 1 h凋亡发生率为16.84％，43℃ 1 h处理．凋亡达20.92％、对照为3.21％。

讨论
本实验结果表明，加温本身对耐药细胞有杀伤作用．可以提高VCR、DNR细胞毒性作用，而且加温与加药顺序对VCR细胞毒性作用有影响．先加VCR再加温效果更好。此外．加温与CDA—II有明显协同作用(CDA—II为人尿中提取的生物制剂．有诱导细胞分化作用)，这些为临床上肿瘤耐药的逆转及肿瘤综合治疗提供了依据，很有临床意义。
经形态学(光镜、电镜)，生化学(TUNEL法)，及流式细胞仪分析证实，加温可诱导细胞凋亡，其发生的时间较快，与所加温度高低有关。43℃ 1 h处理后，24h即可观察到明显细胞凋亡．且可发现部分细胞死亡。42℃ 1 h处理后，24h也有一定比例细胞发生凋亡，4d后测细胞存活率，约25％细胞死亡：作逆转研究时，42℃ 1 h处理，使细胞存活率为57％，较不加温单加相同浓度VCR对照组有明显．差异。表明加温对细胞凋亡的诱导与耐药性的逆转：合关。此外，CDA-II也可诱导细胞凋亡．而加混与CDA-II有极显著协同逆转作用、进一步证实 了这一点。
据认为加温后细胞死亡可分为两种模式．快死亡及慢死亡[7]。细胞凋亡的途径可分为细胞周期依赖性及细胞周期非依赖性[8]，前者发生较缓慢，后者发生很快。加温后细胞死亡的两种模式是否就与细胞凋亡的两种途径有关。虽然42℃ 1 h处理24h后细胞凋亡率不是很高，但逆转效果明显，是否改变了细胞凋亡域值[9]，增加了对抗癌药敏感性．待进一步探讨以证实。此外．加温对肿瘤细胞膜会造成损伤．而肿瘤多药耐药基因表达蛋白P—gp为跨膜糖蛋白，其表达和功能在加温时会受到影响[10]．因此．加温对耐药性的逆转，可能是多因素的综合作用。加温对肿瘤细胞凋亡的诱导．在加温逆转肿瘤细胞耐药性中可能起着重要作用。

    (本文流式细胞术分析由重庆医科大学儿童医院仪器室李欣协助，透视电镜观察出重庆医科大学电镜室协助．特志谢。)

参考文献
1. Ned B.Hornback MD. Historical aspects of hyperthermia in cancer therapy. Radiol Clin North Am.1989,27:481-487.
2. 佐野耀太朗．消灭癌症；尿疗法见证．曾雪玫，译．台北县新店市世茂出版社，1997：28．
3. Bose R. Verheij M. Haimovitz- Friedman A. et al. Ceramide symthase mediates daunorubicin-induced apoptosis: A alternative mechanism for generating death signals. Cell, 1995,82:405-414.
4. 张晓红，张福荣，秀娟，等．KB细胞耐药株的建立及其耐药机制的探．药学学报，1994，29：246—251．
5.  Carmichael L, DeGraff WG, Gazdar AF, et al. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res, 1987,47:936-942.
6. Walker PR, Smith C, Yoddale T, et al. Topoisomerase 11-reactive chemo-therapeutic drug induce apoptosis in thymocytes. Cancer Res, 1991.51:1078-1085.
7. Lidar L, Dewey WC. Two distinct modes of hyperthermic cell death. Radiat Res. 1988,116:157-171.
8. 贾随旺．细胞凋亡与肿瘤化疗及耐药．国外医学肿瘤学分册。1998，25(增刊)：56—58。
9. Fisher DE, Apoptosis in cancer therapy: Crossing the threshold. Cell, 1994,78:539-542.
10.  宋燕爽、刘洪，王立梅，等．加温或化疗药对结场癌细胞系THC-8908多药耐药基因表达的影响。中国肿瘤临床．1997，24：131-134。